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非蛋白質(zhì)巰基含量檢測試劑盒說(shuō)明書(shū)-可見(jiàn)分光光度法

非蛋白質(zhì)巰基含量檢測試劑盒說(shuō)明書(shū)   可見(jiàn)分光光度法
注意:正式測定之前選擇 2-3 個(gè)預期差異大的樣本做預測定。
規格:50T/24S
產(chǎn)品內容:
提取液一:液體 25mL×1 瓶,4℃保存。
提取液二:液體 25mL×1 瓶,4℃保存。
試劑一:液體 50mL×1 瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1 瓶,4℃避光保存。臨用前加入 5mL 無(wú)水甲醇充分溶解備用。
標準品:粉劑×1 支,10mg半胱氨酸,4℃保存。臨用前加入 1.65mL 提取液溶解為 50μmol/ml 的半胱氨酸標準溶液。
提取液的配制:將提取液一和提取液二按體積比 1:1 的比例混合配制,按照樣本數量配制并在當天用完。
產(chǎn)品說(shuō)明:
生物體內巰基主要包括非蛋白質(zhì)巰基和蛋白質(zhì)巰基。巰基化合物在體內具有重要的解毒功能, 對生物體的自我調節具有非常重要的生理意義。
巰基基團與 5,5’- 二硫代-雙-硝基苯甲酸(DTNB)反應,生成黃色化合物,在 412nm 處有最大吸收峰。
自備實(shí)驗用品:
可見(jiàn)分光光度計、離心機、恒溫水浴鍋、1mL 玻璃比色皿、甲醇、研缽/勻漿器和蒸餾水。
操作步驟:
一、樣品的制備
1、 動(dòng)物、植物組織:稱(chēng)取約 0.1g,加入 1mL 的提取液,制備成 10%的勻漿,10000g,常溫離心
10min,取上清待測。
2、   細胞:按照細胞數量(104 個(gè)):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬(wàn)細胞加入 1mL  提取液),超聲波破碎細胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時(shí)間 3min)然后 10000g,4℃離心 10min,取上清置冰上待測。
3、   血清(漿),培養液:向 0.1mL 血清(漿)或培養液中加入 1mL 提取液,10000g,常溫離心10min,取上清待測。
二、測定步驟
1、分光光度計預熱 30min 以上,調節波長(cháng)至 412nm,蒸餾水調零。
2、將 50μmol/mL 標準溶液用提取液稀釋至 0.3、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125μmol/mL 的標準液,現用現配。
3、操作表
 
對照管
測定管
標準管
空白管
上清液(mL)
0.3
0.3
-
-
標準品(mL)
-
-
0.3
-
試劑一(mL)
0.65
0.65
0.65
0.65
試劑二(mL)
-
0.1
0.1
-
H2O(mL)
0.1
 
 
0.4
混勻,室溫放置 10min,測定 412nm 吸光值,分別記為 A 對照、A 測定、
A 標準、A 空白,計算?A 測定=A 測定-A 對照,算?A 標準=A 標準-A 空白。
三、計算公式
1、 標準曲線(xiàn)的繪制:
以標準液濃度為 x 軸,?A 標準為 y 軸,繪制標準曲線(xiàn),得到標準方程 y=kx+b,將?A 測定代入公式得到 x(μmol/mL)
2、 非蛋白質(zhì)巰基含量計算:
(1) 按樣本鮮重計算:
非蛋白質(zhì)巰基含量(μmol/g 鮮重)=x×V 提取÷W=x÷W
(2) 按血清、培養液體積計算:
非蛋白質(zhì)巰基含量(μmol/mL)=x×(V 提取+V 液體)÷V 液體=1.1×x。
(3) 按細胞數量計算:
非蛋白質(zhì)巰基含量(μmol/104 cell)=x×V 提取÷500=0.002×x。
V 提?。杭尤胩崛∫后w積,1mL;W:樣品質(zhì)量,g;Cpr,樣本蛋白濃度,mg/ml;500:500 萬(wàn)個(gè)細胞;V 液體:血清(漿)或培養液體積,0.1mL。
注意事項:
1、當吸光值大于 1.2 時(shí),建議將上清液用提取液稀釋后測定;吸光值過(guò)小時(shí),建議提高樣品質(zhì)量或體積進(jìn)行測定。
 
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