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組織糖原磷酸化酶 a 活性酶連續循環(huán)比色法定量檢測試劑盒-技術(shù)資料/價(jià)格-赫澎上海生物


HEPENGBIO 組織糖原磷酸化酶 a 活性酶連續循環(huán)比色法定量檢測試劑盒
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
 
主要用途
 
HEPENGBIO 組織糖原磷酸化酶 a 活性酶連續循環(huán)比色法定量檢測試劑是一種旨在通過(guò)糖原磷酸化酶 a 、 磷酸葡萄糖變位酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的酶連續反應系統中氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP) 還原后峰值的增高,即采用比色法來(lái)測定組織裂解萃取樣品中酶活性的方法。其適用于各種組織裂解萃取懸液樣品 (動(dòng)物、人體、 昆蟲(chóng)等) 糖原磷酸化 酶 a 的特異活性檢測。產(chǎn)品嚴格無(wú)菌,即到即用,操作簡(jiǎn)捷,性能穩定。
技術(shù)背景
 
糖原磷酸化酶 (glycogen phosphorylase;EC2.4. 1. 1) 是磷酸化酶家屬之一,在機體糖原分解 (glycogenolysis ) 利用上發(fā)揮重要作用。其結構為同源雙體,有兩種組合形式:緊密型 (tense) 和松弛型 (relaxed) 。處于緊 密型的酶與糖原結合,增強活性。未經(jīng)修飾的酶 (糖原磷酸化酶b) 催化產(chǎn)生足夠的葡萄糖- 1-磷酸,進(jìn)入  糖酵解循環(huán),生成ATP 。糖原磷酸化酶催化糖原上α  (1→4) 糖苷鏈 (glycosidic linkage) 的磷酸分解       (phosphorolytic cleavage) 反應,釋放葡萄糖- 1-磷酸產(chǎn)物。糖原磷酸化酶在肝組織、肌肉組織和腦組織中 有不同類(lèi)型的異構體。糖原磷酸化酶分為a型和b型:a型為活化狀態(tài),而b型為非活化狀態(tài),在單磷酸腺苷  (AMP) 的激活下,轉化為a型。糖原磷酸化酶的缺失將導致肌肉營(yíng)養不良癥 (McArdle綜合征) 和肝磷酸 化酶缺乏癥 (Hers病) ?;诘孜锾窃?(glycogen),在糖原磷酸化酶無(wú)需AMP激活劑的存在, 由糖原磷酸 化酶a催化其分解并產(chǎn)生葡萄糖- 1-磷酸 ( α-D-Glucose- 1-Phosphate ) 產(chǎn)物后,通過(guò)磷酸葡萄糖變位酶        (phosphoglucomutase;PGLUM) 和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 (glucose-6-phosphate dehydrogenase;G-6-PDH) 反應系統,測定氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP) (oxidized nicotinamide adenine dinucleotide        phosphate ;NADP) 轉化為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (reduced nicotinamide adenine dinucleotide               phosphate ;NADPH) 所產(chǎn)生的吸光峰值的變化 (340nm  波長(cháng)) ,來(lái)定量分析糖原磷酸化酶a 的特異活性。 糖原磷酸化酶a酶連續循環(huán)反應系統為:
 
glycogen phosphorylase a
(glycogen) n       +    Pi               →       (glycogen) n-1    +    α-D-Glucose- 1-Phosphate
 
phosphoglucomutase
α-D-Glucose- 1-Phosphate                   →     α-D-Glucose-6-Phosphate
 
glucose-6-phosphate dehydrogenase
α-D-Glucose-6-Phosphate    +    β-NADP    →  6-Phosphogluconate      +    β-NADPH
(低吸收峰)                               (高吸收峰)
 
產(chǎn)品內容

HEPENGBIO 清理液 (Reagent A)                                          30 毫升
HEPENGBIO 裂解液 (Reagent B)                                           6 毫升
HEPENGBIO 緩沖液 (Reagent C)                                          10 毫升
HEPENGBIO 底色液 (Reagent D)                                           1 毫升
HEPENGBIO 反應液 (Reagent E)                                           1 毫升
HEPENGBIO 陰性液 (Reagent F)                                         500 微升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)                                                            1 份
 
保存方式
 
保存 HEPENGBIO 緩沖液 (Reagent C)、HEPENGBIO 底色液 (Reagent D) 和 HEPENGBIO 反應液  (Reagent E) 在-20℃冰箱里;  其余的保存在 4℃冰箱里,HEPENGBIO 底色液 (Reagent D) 和     HEPENGBIO 反應液 (Reagent E) 避免光照;有效保證 6 月
 
用戶(hù)自備
 
1.5 毫升離心管:用于樣品制備和保存的容器
15 毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器
(微型) 臺式離心機:用于樣品制備
比色皿或 96 孔板:用于比色的容器
分光光度儀或酶標儀:用于比色分析
 
實(shí)驗步驟
 
實(shí)驗開(kāi)始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的 HEPENGBIO 裂解液 (Reagent B) 置入冰槽里融化。然后 進(jìn)行下列操作。
 
一、  樣品準備
 
1 .  手術(shù)取出動(dòng)物組織,并秤重以確定組織重量
2 .   (選擇步驟) 放進(jìn)預冷的 15 毫升錐形離心管
3 .   (選擇步驟) 加入適量的 (500 毫克組織需要 3 毫升) HEPENGBIO 清理液 (Reagent A) 清洗 1 次
4 .  移入到一個(gè)液氮凍存管
5 .  即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)夜
6 .  次日從液氮罐里取出,即刻 (最快速度) 用研磨棒碾碎組織成粉末狀 (注意:切莫使組織凍融)
7 .  放進(jìn)一個(gè) 15 毫升錐形離心管
8 .  加入置于冰槽里的 500 微升 HEPENGBIO 裂解液 (Reagent B)
9 .  轉移到 1.5 毫升離心管
10.強力渦旋震蕩 30 秒,充分混勻
11.放進(jìn)冰槽里孵育30 分鐘,期間每 10 分鐘強力渦旋震蕩 30 秒 (注意:如需暫時(shí)停止,放進(jìn)-70℃冰箱 里儲存備用)
12.即刻放進(jìn) 4℃微型臺式離心機離心 10 分鐘,速度為 16000g   (或 13000RPM。例如 EPPENDORF 5415)
13.小心移取上清液到新的 1.5 毫升離心管
14.移取 10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測 (注意:建議使用HEPENGBIO Bradford  蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒

)
15.放進(jìn)-70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用
二、  測定準備
 
1 .  開(kāi)啟并設定好分光光度儀 (溫度為 30℃):波長(cháng) 340nm ,間隔 60 秒,讀數 6 次 (共 5 分鐘),并置零
2 .  從-20℃冰箱里取出試劑,置于冰槽里融化;HEPENGBIO 底色液 (Reagent D) 避免光照
3 .  HEPENGBIO 緩沖液 (Reagent C) 室溫下均衡溫度
 
三、  背景對照測定
 
1 .  移取 780 微升 HEPENGBIO 緩沖液 (Reagent C) 到新的比色皿
2 .  加入 100 微升 HEPENGBIO 底色液 (Reagent D)
4 .  加入 100 微升 HEPENGBIO 反應液 (Reagent E)
5 .  上下傾倒數次,混勻
6 .  在 30℃溫度下孵育 3 分鐘
7 .  加入 20 微升 HEPENGBIO 陰性液 (Reagent F)
8 .  上下傾倒數次,混勻 (限定在 3 秒之內)
9 .  即刻放進(jìn)分光光度儀檢測,此為背景空對照 (5 分鐘讀數-0 分鐘讀數)
 
四、  樣品測定
 
1 .  移取 780 微升 HEPENGBIO 緩沖液 (Reagent C) 到新的比色皿
2 .  加入 100 微升 HEPENGBIO 底色液 (Reagent D)
3 .  加入 100 微升 HEPENGBIO 反應液 (Reagent E)
4 .  上下傾倒數次,混勻
5 .  在 30℃溫度下孵育 3 分鐘
6 .  加入 20 微升待測樣品 (100 微克蛋白) (注意:樣品須清澈,且pH  為6.8)
7 .  上下傾倒數次,混勻 (限定在 3 秒之內)
8 .  即刻放進(jìn)分光光度儀檢測,此為樣品讀數 (5 分鐘讀數-0 分鐘讀數)
 
五、  計算樣品活性
 
[  (樣品讀數-背景讀數) X 1  (體系容量;毫升) X 樣品稀釋倍數]÷ [0.02  (樣品容量;毫升) X 6.22  (毫摩 爾吸光系數) X 5  (反應時(shí)間;分鐘) ] =單位/毫升÷  (樣品蛋白濃度) 毫克/毫升=單位/毫克
 
單位=微摩爾 NADP/分鐘
 
六、  酶標儀測定
 
1 .  在 96 孔板上做好相應標記:背景對照和樣品
2 .  分別移取 195 微升 HEPENGBIO 緩沖液 (Reagent C) 到所有孔里
3 .  分別加入 25 微升 HEPENGBIO 底色液 (Reagent D) 到所有孔里
4 .  分別加入 25 微升 HEPENGBIO 反應液 (Reagent E) 到所有孔里
5 .  輕輕搖動(dòng) 96 孔板

6 .  在 30℃溫度下孵育 3 分鐘
7 .  分別加入 5 微升 HEPENGBIO 陰性液 (Reagent F) 或待測樣品 (100 微克蛋白) (注意:樣品須清 澈,且pH  為6.8) 到相應孔里
8 .  輕輕搖動(dòng) 96 孔板
9 .  即刻放進(jìn)酶標儀檢測,包括 0 分鐘讀數和 5 分鐘讀數)
10.活性計算
 
[  (樣品讀數-背景讀數) X 樣品稀釋倍數 X 0.25  (體系容量;毫升) ]÷ [0.005  (樣品容量;毫升) X 6.22  (毫摩爾吸光系數) X 0.6  (光徑距離;厘米) X 5  (反應時(shí)間;分鐘) ] =單位/毫升÷  (樣品蛋白濃度) 毫 克/毫升=單位/毫克
單位=微摩爾 NADP/分鐘
 
注意事項
 
1 .  本產(chǎn)品為 10 次 (比色皿) 和 40 次 (酶標儀) 操作,包括背景對照
2 .  操作時(shí),須戴手套
3 .  系統操作過(guò)程中,背景測定只需 1 次
4 .  建議使用比色皿測定
5 .  樣品須澄清,至關(guān)重要
6 .  加樣后3 秒內比色測定
7 .  測定值由低到高變化;測定可持續 5 分鐘
8 .  比色測定后,比色皿須清洗徹底
9 .  樣本測定 5 分鐘讀數高于 0 分鐘讀數表明具有酶活性
10.建議待測樣本蛋白濃度為 100 微克/20 微升;如果樣本酶活性過(guò)低或過(guò)高,  則可以增加或降低樣本量 (本公司提供  Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒- )
11.如果待測樣品濃度過(guò)高或過(guò)低,可以調整樣品濃度
12.糖原磷酸化酶 a 單位活性定義為:在 30℃,pH 6.8 條件下,每分鐘內能夠轉化 1 微摩爾糖原和正磷酸 (orthophosphate ) 至葡萄糖- 1-磷酸所需的酶量作為一個(gè)活性單位
13.本公司提供系列細胞磷酸化酶學(xué)檢測試劑產(chǎn)品
 
質(zhì)量標準
 
1 .  本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩定
2 .  本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感
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